Разработана новая методика секвенирования ДНК и РНК

Японские учёные создали метод амплификации и секвенирования ДНК (TAS-Seq), который повышает точность секвенирования РНК отдельных клеток (scRNA-seq). В основе TAS-Seq лежит использование терминальной трансферазы – фермента, который амплифицирует и секвенирует ДНК, комплементарную мРНК (кДНК), – в твёрдой фазе на платформе, представляющей собой нанолунки с магнитными шариками. А применение дидезоксинуклеотидтрифосфата (ddNTP) позволяет остановить реакцию секвенирования, катализируемую терминальной трансферазой, что помогает уменьшить долю вариаций и ошибок при считывании. Результаты работы были опубликованы в журнале Communications Biology. Ведущий автор исследования ­– Кодзи Мацусима (Kouji Matsushima), PhD, доцент Токийского научного университета (Tokyo University of Science).

Новый метод обеспечивает высокую точность определения клеточного и внеклеточного состава тканей, он чувствителен в отношении идентификации генов и позволяет оценить механизмы межклеточных взаимодействий. Вместе с тем TAS-Seq, благодаря использованию терминальной трансферазы, прост в применении. Всё это результат технического прогресса: теперь простые материалы и оборудование позволяют получать весомые результаты, изучать этиологию и патогенез заболеваний на внутриклеточном и межклеточном уровнях и находить мишени воздействия для лекарственных средств.

Исследование отдельных клеток необходимо для изучения сложных многоклеточных и гетерогенных биологических систем на более глубоком уровне, недоступном при массовом усреднённом анализе. Существующие технологии секвенирования РНК на основе планшетов с жидкой фазой влияют на состав клеточных образцов и имеют ограничения при амплификации кДНК, из-за этого появляются систематические ошибки, искажающие данные для целой выборки.

TAS-Seq выполняется на платформе нанолунок с магнитными шариками с применением терминальной трансферазы и дидезоксинуклеотидтрифосфата. Он позволяет секвенировать РНК отдельных клеток для получения высокоточной информации об экспрессии генов, составе клеток и о межклеточных взаимодействиях (Токийский научный университет)

Авторы отмечают: «TAS-Seq продемонстрировал высокую устойчивость к вариабельным реакциям с терминальной трансферазой, нехарактерную для существующих сегодня методик секвенирования РНК, таких как 10X Chromium v2 и Smart-seq2».

Учёные, используя образцы лёгких мышей и людей, сравнили данные секвенирования РНК на основе TAS-Seq и проточной цитометрии и оценили корреляции. Помимо высокой чувствительности при идентификации генов TAS-Seq обладает ещё одним важным свойством – он позволяет описывать межклеточные взаимодействия и анализировать экспрессию факторов роста и интерлейкинов.

«Метод TAS-Seq превосходит 10X Chromium v2 и Smart-seq2 по чувствительности идентификации генов и производительности. Более того, он позволяет оценивать уровни экспрессии. Широкое внедрение TAS-Seq даст возможность изучать процессы в органах на уровне отдельных клеток», – поясняет ведущий автор исследования Шигеюки Шичино (Shigeyuki Shichino), PhD, доцент Токийского научного университета.

В отличие от полимеразы, используемой при амплификации ДНК, для терминальной трансферазы не требуется матрица. Однако необходимо было решить проблему терминации реакции, поэтому учёные применили ddNTP.

Шичино объясняет: «Использование ddNTP и дидезоксицитидинфосфата (ddCTP) стохастически останавливает чрезмерное удлинение N-конца терминальной трансферазы. Это значительно снижает технические трудности при её применении».

Новый метод позволяет минимизировать систематические ошибки за счёт анализа отдельных клеток на платформе, в основе которой нанолунки. Ещё одно преимущество TAS-Seq – его меньшая восприимчивость к периодическим эффектам. При сравнении данных метода TAS-Seq и проточной цитометрии была выявлена высокая корреляция, это указывает на возможность получения достоверной информации о клеточном составе.

«Мы уже завершили разработку TAS-Seq2 – это оптимизированная версия TAS-Seq. Она оказалась в 1,5-2 раза чувствительнее в отношении идентификации генов в клетках селезёнки мыши», – говорит Шичино.

Исследователи из Токийского научного университета создали компанию ImmunoGenetics, которая будет предоставлять услуги секвенирования РНК с использованием нового метода.