Новый вид CRISPR для таргетирования РНК, включая РНК-вирусы, такие как коронавирус

Генетический анализ, основанный на CRISPR, помог ученым идентифицировать гены, которые являются более значимыми при серповидноклеточной анемии, иммунотерапии рака, метастазировании рака легких и многих других заболеваниях. Однако эти генетические тесты имеют ограничения: они способны редактировать только ДНК. Для многих областей человеческого генома таргетирование ДНК может быть неэффективным. Для других организмов, таких как РНК-вирусов, например, коронавирусов или вирусов гриппа, анализ ДНК является бесполезным.

Согласно результатам нового исследования, опубликованным в Nature Biotechnology, исследователи из лаборатории Невилла Санджаны (Neville Sanjana), PhD, представляющего Нью-Йоркский Центр генома (New York Genome Center) и Нью-Йоркский Университет (New York University), разработали новый вид технологии CRISPR-анализа, нацелившись на РНК.

Ученые использовали описанный фермент CRISPR под названием Cas13, который нацелен на РНК, а не на ДНК. Используя Cas13, они разработали оптимизированную платформу для массово-параллельных генетических анализов на уровне РНК в клетках человека. Эта технология скрининга может быть использована для понимания многих аспектов регуляции РНК и определения функции некодирующих РНК.

Нацеливаясь на тысячи различных участков в транскриптах РНК человека, исследователи разработали прогностическую модель на основе искусственного интеллекта, чтобы ускорить идентификацию наиболее эффективных направляющих РНК Cas13. Новая технология доступна исследователям через интерактивный веб-сайт и предоставленный в открытом доступе арсенал с исходным кодом для прогнозирования эффективности направляющей РНК для нацеливания на РНК и обеспечивает предварительно разработанные гидовые РНК для всех генов, кодирующих белок человека.

«Мы предполагаем, что РНК-таргетные ферменты Cas13 повлияют на молекулярную биологию и медицинское применение, но мало что известно о разработке направляющих РНК для высокой эффективности таргетирования», − говорит доктор Санджана, главный автор исследования. «Мы намерены изменить это с помощью углубленного и систематического исследования для разработки ключевых принципов и прогнозного моделирования для наиболее эффективного проектирования инструкций».

Доктор Санджана является ведущим преподавателем в Нью-Йоркском Центре генома, старшим преподавателем биологии в Нью-Йоркском Университете и старшим преподавателем неврологии и физиологии в Медицинской школе Нью-Йоркского Университета (NYU School of Medicine).

Ферменты Cas13 − это ферменты типа VI, которые недавно были идентифицированы как программируемые РНК-управляемые РНК-таргетные белки с нуклеазной активностью, целью которых является нокдаун гена без изменения генома. Это свойство делает Cas13 потенциально значимым терапевтическим средством для влияния на экспрессию генов без постоянного изменения последовательности генома.

«Это своего рода технологическая инновация, которой мы содействуем в развитии в Нью-Йоркском Центре генома. Эта новейшая технология CRISPR из лаборатории Санджаны имеет ошеломляющие последствия для развития областей геномики и точной медицины», − говорит Том Маниатис (Tom Maniatis), PhD, директор по научным исследованиям Эвнин Фэмили (Evnin Family) и директор Нью-йоркского Центра генома.

Постдок Ханс-Герман Вессельс (Hans-Hermann Wessels) и аспирант Алехандро Мендес-Мансилья (Alejandro Méndez-Mancilla), которые являются соавторами первого исследования, разработали набор новых инструментов на основе Cas13, провели расшифровку и пермутационный анализ в клетках млекопитающих. В общей сложности исследователи собрали информацию для более чем 24 000 руководств по таргетированию РНК.

«Мы могли бы проводить РНК через множество различных транскриптов, включая несколько генов человека, где мы могли бы легко измерить нокдаун транскриптов с помощью окрашивания антителами и проточной цитометрии», − утверждает доктор Вессельс. «Попутно мы сделали некоторые занимательные биологические открытия, которые могут расширить применение РНК-таргетных ферментов Cas13». После формирования выводов в группе появилось понимание того, какие области направляющей РНК более важны для распознавания нацеленности РНК. Используя тысячи направляющих РНК с 1, 2 или 3 однобуквенными несоответствиями их целевой РНК, они определили критическую «семенную» область, которая чрезвычайно чувствительна к несоответствиям между направляющей CRISPR и целью. Это открытие поможет ученым в разработке направляющих РНК, чтобы избежать нецелевой активности на непреднамеренных целевых РНК. Поскольку типичная человеческая клетка экспрессирует приблизительно 100 000 РНК, точное нацеливание Cas13 только на предполагаемую цель жизненно важно для исследования и терапевтического применения.

В дополнение к пониманию о побочных мишенях Cas13, область «семян» может быть использована для биосенсоров следующего поколения, которые могут более точно различать близкородственные виды РНК. В общей сложности это исследование увеличивает количество опорных точек из предыдущих исследований Cas13 в клетках млекопитающих более чем на два порядка.

«Мы очень рады использовать оптимизированную систему скрининга Cas13 для таргетирования некодирующих РНК», − говорит соавтор первого исследования Мендес-Мансилья. «Это значительно увеличивает набор инструментов CRISPR для прямых генетических и транскриптомных анализов». В ходе исследования ученые заметили очевидную разницу в нокдауне белков при нацеливании на различные белоккодирующие и некодирующие элементы информационных РНК и обнаружили доказательства того, что Cas13 конкурирует с другими РНК-связывающими белками, участвующими в обработке транскриптов и сплайсинге.

Команда недавно использовала свою модель прогнозирования РНК-гида для особо важного анализа: чрезвычайная ситуация в области общественного здравоохранения COVID-19 вызвана коронавирусом, который содержит РНК, а не ДНК-геном. Используя модель, полученную из их массово-параллельных анализов, исследователи определили оптимальные направляющие РНК, которые могут быть использованы для будущего обнаружения и терапевтического применения.

 Источник перевода: sciencedaily.com

Автор: Марианна Королева